miércoles, 1 de febrero de 2012

MUTAGÉNESIS

En las entradas anteriores nos hemos centrado en mutaciones espontáneas, que son las que se producen por errores de copia o de forma natural, pero existen causas químicas, físicas y biológicas que pueden producir mutaciones también. En el caso de las químicas, se conocen unas moléculas llamadas análogas de bases, que tienen una estructura molecular similar a las bases nitrogenadas y pueden ser incorporadas a la cadena. El problema viene cuando dicha cadena va a ser copiada y genera en ocasiones un error en la hebra complementaria. Otras causas químicas son los agentes alquilantes (como la nitrosoguanidina), que reaccionan con las bases del DNA, que genera apareamientos erróneos y modifica la cadena de ADN antes del apareamiento a diferencia de los análogos de bases. Otros químicos que producen error son los agentes intercalantes, que se interponen entre dos pares de bases
Entre los causantes físicos tenemor las radiaciones, divididas en dos tipos: ionizantes y no ionizantes. Las bases nitrogenadas tienen capacidad de absorber la radiación UV con un máximo para el ADN y ARN de 260 nm de longitud de onda. Las proteínas en cambio pueden absorber un máximo de 180 nm debido a que existen aminoácidos aromáticos que como triptófano y fenilalanina. La radiación UV puede producir daños en el ADN importantes debido a la formación de los llamados dímeros de pirimidina, que resultan de la unión de dos bases como la citosina y timidina de forma covalente con la consecuente incremento de probabilidad de error de la polimerasa al insertar un nucleótido. La radiación UV puede producir la muerte de un elevado número de bacterias por la ruptura del ADN.
La radiación ionizante es la más dañina. Tiene longitudes de onda menores, pero eso hace que sea más energética. Este tipo de radiación se encuentra en los rayos X, rayos gamma y rayos cósmicos entre otros. Dichas radiaciones producen la ionización del agua y otros compuestos. Forman radicales libres como el hidroxilo OH-, que reaccionan con las macromoléculas de las células inactivándolas, como es el caso del ADN. El problema de afectar al ADN es que esta molécula al ser la portadora de la información genética, si es dañada el daño es permanente, lo cual produce la muerte de la célula dañada.

VELOCIDAD Y TASAS DE MUTACIÓN

Hemos visto que las mutaciones pueden ser de muchos tipos, puntuales cuando afectan a un par o unos pocos pares de bases, o estructurales, cuando afectan a unos cientos o miles de pares de bases, pero ¿con que velocidad las células padecen mutaciones? Nos centramos en este blog en las células procariotas, esto es, bacterias y arqueobacterias, por lo que no entraremos a analizar mutaciones estructurales cromosómicas eucariotas. En bacterias, las mutaciones por errores de replicación de DNA afectan a un par de bases por ciclo una vez de entre cada 10 elevado a 7 y 10 elevado a 11. Como las bacterias tienen genes con aproximadamente 100 pares de bases por gen, en cada ciclo de división hay 10 elevado menos 4 y 10 elevado a menos 7 mutaciones por gen.
Entonces, ¿tienen todos los genes las mismas probabilidades de mutación? No, ya que las mutaciones silenciosas, por ejemplo tienen menos frecuencia (10 elevado a menos 7) ya que hay menos tripletes que contengan la secuencia UAG por ejemplo de terminación de traducción. Otras mutaciones como las transposiciones tienen una frecuencia de una vez cada 10 elevado a 4, lo cual es bastante. Finalmente existen unas secuencias llamadas hot spots o puntos calientes que son las que más tendencia tienen a mutar, ya que son secuencias cortas repetidas en las que la DNA polimerasa de la replicación tiende a cometer más errores.

MUTACIONES Y RECOMBINACIÓN BACTERIANA

Entendemos por mutación una variación en la secuencia de ácidos nucléicos del genoma de un organismo que resulta hereditaria. Al nuevo genotipo mutante se le llama mutante, frente al genotipo no mutante, llamado silvestre o salvaje. El fenotipo se nombra indicando con un + o un - la presencia de la proteína: Por ejemplo, His+ significará que la bacteria puede sintetizar la proteína Histidinol-fosfato aminotransferasa. Aquellas mutaciones que causan una ventaja en el organismo y por tanto son seleccionables se pueden detectar mediante un rastreo o screening, visualizando muchas colonias bacterianas. Se pueden hacer selecciones mediante adición de antibióticos para ver si el mutante resiste, o mediante réplica en placa mediante un terciopelo que permita una impresión en una placa de agar sin un nutriente y ver cuales crecen (las paternales si, las mutantes no). Aquellos mutantes que requieren un factor de crecimiento se llaman auxótrofos y derivan de los llamados protótrofos.
Un método de selección de mutantes auxótrofos es la selección con penicilina, que mata a las bacterias que están creciendo. Esto sirve para que se incuben primero los auxótrofos que les falta un nutriente, luego se añade la penicilina y se lava. Consituye un método de selección negativa porque no favorece al mutante, sino que perjudica al parental

TIPOS DE MUTACIONES:
Pueden ser “espontáneas”, que ocurren por errores en la replicación del ADN, Inducidas por culpa de radiaciones o agentes químicos. Se llaman puntuales cuando afectan a un par de bases o unos pocos, y pueden ser a su vez sustituciones, o pequeñas microinresciones o microdeleciones de nucleótidos. Por ejemplo, tenemos un gen con la secuencia TAC y la complementaria ATG. Ésta se transcribe a UAC. Dicha secuencia de ARNm codifica para el aminácido tirosina. Si se da una mutación que afecta a UAC y cambia a UAU, el aminoácido resultante seguirá siendo tirosina, por que el codón triplete coincide, y en este caso tendremos una mutación puntual silenciosa. Pero si la mutación hace que UAC pase a ser AAC, se codificará al aminoácido asparagina, lo que provocará una proteína defectuosa. Ello puede hacer que la proteína cambie su estructura y su sensibilidad por ejemplo a temperatura. Otro posible cambio es la llamada mutación sin sentido, como sería la que daría lugar a UAG, que es el codón de parada o terminación. Llamamos mutación por desfase a aquellas en las que una adición de un nucleótido provoca un desfase en el marco de lectura de tripletes, por lo que un mecanismo es añadir otros 2 nucleótidos que puedan corregir parte del efecto. La proteína resultane puede salir defectuosa o normal.
Ante las mutaciones puntuales, existen reversiones o mutaciones hacia atrás, que consisten en un proceso de revertientes (esto significa que se vuelve al fenotipo original) bien por reversión en el mismo sitio de la secuencia, o por una nueva mutación que restaura la función cambiada en la primera, o por revertientes de segundo sitio, que a su vez pueden ser reversiones en otra parte del gen afectado, o en otro gen que sintetiza una enzima que produce el fenotipo salvaje.
Hasta ahora nos hemos centrado en mutaciones puntuales, que bien afectan a un par de bases, o bien a unos pocos, pero existen mutaciones más profundas que afectan a muchos pares de bases nitrogenadas. Así las deleciones son mutaciones en las que se pierden cientos o miles de pares de bases. Esto produce la pérdida de la función de la proteína, y no puede repararse por reversión, sino solo por recombinación. Las inserciones son adiciones de muchas bases, lo que suele ocurrir durante errores de recombinación. Las grandes insercioenes si se pueden revertir por posteriores deleciones. Otras grandes mutaciones son las translocaciones en las que largas secuencias cambian su posición en el genoma, y las inversiones, en las cuales se invierte la posición de una secuencia de nucleótidos.

martes, 13 de diciembre de 2011

PARED CELULAR BACTERIANA

Las bacterias tienen una enorme presión osmótica en su interior, lo que produce que haya un equivalente de 2 atmósferas de presión. Por esto, además de el hecho de que muchas especies vivan en condiciones extremas de salinidad, temperatura o presión, poseen una estructura protectora, la pared celular. Ésta se encuentra sobre la membrana plasmática. Además de proteger y dar resistencia otorga la forma de la célula. Químicamente está compuesta por un compuesto llamado peptigoglicano o mureína. Éste se compone de 2 tipos de moléculas glucídicas: N-acetilglucosamina y ácido N-acetil murámico. Ambas se unen mediante enlaces beta-1,4, pero existen uniones más fuertas aún que aumentan la rigidez y resistencia de la pared. Esas uniones se producen entre los llamados tetrapéptidos de glicano, unas macromoléculas formadas por la unión de 4 aminoácidos: D-alanina, L-alanina, D-glutámico y lisina (en gram positivas) o ácido diaminopimélico (en gram negativas). Esas uniones transversales a las uniones beta-1,4 dan mayor consistencia. En caso de gram positivas, el 90% de la pared es el peptidoglicano, al que se añaden alcoholes llamados ácidos ticoicos, unos derivados de glúcidos que aportan carga negativa y favorecen el intercambio iónico entre el interior y exterior celular.

En bacterias gram negativas el peptidoglicano es sólo el 10% de la pared, que está ocnsituida además por una capa membranosa externa a ésta llamada membrana de lipopolisacáridos. Ésta está formada por polisacáridos unidos a lípidos y representa un alto porcentaje de la composición total de la pared (mide más de 10 nm de grosor). Esta membrana externa de lipopolisacáridos, tamién llamada LPS está formada por tres tipos de componentes: el lípido A, el núcleo del polisacárido y el polisacárido específico O. El lípido A es un tipo de lípido formado por la unión de cadenas de ácidos grasos a oligosacáridos de N-acetilglucosamina por enlaces éster-amino. Confiere el carácter tóxico a las becterias Gram negativas debido al caracter de las endotoxinas que contiene el lípido A. El núcelo del polisacárido está formado por la molécula KDO (cetodesoxioctonato), varias heptosas (monosacáridos de 7 carbonos) y uniones de glucosas con galactosas. Finalmente el polisacárido O presenta repeticiones de glucosas, galactosas, manosas, ramnosas, abecuosas y tivelosas. La membrana de LPS contiene además unas proteínas porinas que con un diámetro de cerca de 1 nm permiten el paso de determinadas moléculas pequeñas hidrofílicas y aumenta la permeabilidad.
La clave de la tinción Gram que divide las bacterias en 2 grupos en función de su pared celular, es que las gram negativas, al recibir la tinción y formar un complejo de cristal violeta y Iodo y añadir un alcohol, se puede extraer, lo cual no es posible en gram positivas

lunes, 12 de diciembre de 2011

REPLICACIÒN DEL ADN

Es un proceso fundamental dela vida (bacteriana y eucariota), pues garantiza la transmisión de la información genética. Es un proceso que debe mantenerse con una alta fidelidad de copia, pues a partir de una molécula obtenemos dos genèticamente iguales. Sin embargo, pueden darse errores en la replicación que en una bajísima proporción (del orden de uno cada 100 millones de nucleótidos) que contribuyen a la diversidad de las formas orgánicas.




El proceso requiere un gran aparato multienzimático (replisoma) y está dividido en tres grandes etapas:

INICIACIÓN
ELONGACIÓN
TERMINACIÓN

-La Iniciación consiste en la apertura de la molécula de doble espiral de ADN por unas secuencias llamadas Ori, que son unos genes por donde se abre inicialmente la doble cadena y donde actúan las primeras enzimas del proceso (que se llaman primosoma). El proceso debe ser continuo y no puede pararse ni echarse atrás una vez iniciado, luego es como una especie de interruptor que debe haber superado varios puntos de control (check points). Para ello la célula debe tener suficientes nutrientes y condiciones adecuadas de temperatura. Lo primero para la iniciación es la síntesis de un oligonucleótido de ARN llamado cebador o primer sintetizado por una ARN polimerasa llamada ADN-G. Ésta enzima es capaz de generar ese primer que actúa permitiendo un extremo 3' sobre el cual actuará la ADN polimerasa III de la que hablamos en el apartado de enzimas de la replicación.

-La Elongación consiste en alargar la molécula mediante la adición de nucleótidos gracias a la ADN polimerasa y otras enzimas que actúan en el proceso. La velocidad de copia durante la elongación es muy alta, en bacterias en 20 minutos se replica todo el ADN llegando a una velocidad de 800 nucleótidos por segundo.
Sin embargo una de las dos cadenas se sintetiza continuamente por adición de moléculas en sentido 3' y la otra de forma discontinua, lo que provoca torsiones en esa cadena y fragmentos pequeños llamados fragmentos de Okazaki (longitud de 200 nucleótidos en bacterias frente a 1500 en eucariotas).

-La Tetminación es la última fase, en la que unas secuencias TER indican que el proceso ha finalizado y donde los replicones se fusionan. Es importante que todo esté replicado una sóla vez. La secuencia Ter es fundamental para que el replisoma se acompase con todas las enzimas, y se divide en 3 partes: Ter D, Ter A y Ter E.

Enzimas de replicación bacteriana

Tenemos en primer lugar las proteínas SSB. Éstas forman un grupo de enzimas esenciales porque son las responsables de estabilizar la cadena simple de ADN cuando se separa para la duplicación. Cada una de las proteínas SSB agrupa 4 nucleótidos de cadena, y se necesitan cerca de 1500 por horquilla de replicación (la horquilla es el punto por donde se abren las 2 cadenas)

Las helicasas, son las enzimas encargadas de separar la doble hélice de ADN mediante la ruptura de los enlaces puentes de hidrógeno que unen ambas. Para ello consumen una gran cantidad de energía que obtienen de la hidrólisis del ATP. Son importantes y están muy conservadas en la evolución pese a haberse diversificado mucho en bacterias.

Las proteínas girasa o topoisomerasas, son las encargadas de eliminar tensiones y torsiones producidas en la doble cadena. Para ello realizan cortes en el ADN y luego pegan los extremos. Así eliminan esas tensiones que son necesarias evitar para la replicación correcta. Existen 2 tipos: tipo I y tipo II. Las primeras son monoméricas y realizan un único corte mientras que las segundas son diméricas y hacen 2 cortes, por lo que son muy delicadas y precisas.


Polimerasas: son las proteínas enzimáticas más fundamentales de todas las que participan en la replicación. Presentan una serie de estructuras o motivos comunes que indican sobre el origen común de la vida. Toda ellas replican añadiendo nucleótidos en sentido 5'- 3' y tienen actividad correctora de digestión 3'- 5' con algunas escepciones como la DNA Polimerasa I o de Corberg, responsable de la eliminación de secuencias primers en la hebra retardada o discontinua con actividad exonucleasa 5'-3'. En procariotas existen 4 polimerasas. La I ya explicada, la II que participa en reparación de errores, la III esencial para la elongación o polimeración del ADN y las 4 y 5, propias de respuestas SOS de la bacteria ante grandes daños o mutaciones que pueden poner en peligro la vida de la célula